Ogólny protokół redukcji cystein w roztworze białka lub peptydu

1. Przygotuj 1 M roztwór podstawowy diotreitolu DTT w wodzie, najlepiej świeży. (Staraj się nie wdychać DTT.)
2. Dodać DTT do roztworu białka lub peptydu (który jest w buforze) do końcowego stężenia 1 mM do 10 mM DTT. Inkubuj przez 10 min. do 30 min. Redukcja może działać nieco lepiej, jeśli inkubuje się w wyższej temperaturze, np. 37 stopni C lub 56 stopni C. Jednak temperatura pokojowa lub lód też powinny działać.

Może być konieczna najpierw denaturacja białka lub peptydu przed redukcją DTT. Na przykład możliwe jest użycie mocznika (stężenie 1-8 M) lub SDS (0,1-4%), aby najpierw wystawić cysteiny na kilka minut na lodzie lub w wyższej temperaturze. Alternatywnie można jednocześnie denaturować i redukować.

Redukcja białek lub peptydów w roztworze przed alkilacją

1. Zmniejsz ilość białka jak powyżej.
2. Inkubować próbki białka lub peptydu o zmniejszonej zawartości dwusiarczków przy co najmniej 3-krotnie wyższej molarności NEM niż ta stosowana w przypadku DTT. Inkubuj przez 30 min. do 1 godz.
3. W razie potrzeby dializuj DTT lub NEM.