TBS
20 mM Tris, pH 7,4
150 mM NaCl

TBS Tween TBST (do przemywania plam)
TBS 2L
Tween-20 (brązowa butelka) + 1 ml przez wlanie pipetą pipetą lub plastikową gruszką
mieszać pół godziny

Protokół blottingu:

1. Wytnij kawałek nitrocelulozy 5 cm na 5 cm lub 10 cm na 10 cm, jeśli masz więcej próbek.
2. Usuń górną warstwę papieru z nitrocelulozy. Za pomocą ołówka i linijki zmierz i narysuj na nitrocelulozie siatki o wymiarach 1 cm na 1 cm. Podczas pracy z nitrocelulozą zawsze noś rękawiczki.
3. Umieść górną warstwę papieru z powrotem na nitrocelulozie. Odetnij lewy górny róg nitrocelulozy, aby uzyskać punkt odniesienia.
4. Przy pomocy pincety usuń dwa kawałki papieru na wierzchu i pod kawałkiem nitrocelulozy i umieść bibułkę nitrocelulozową stroną zadrukowaną do góry na szalce Petriego w celu nakropienia.
5. Nakropić 2-5 ul żądanego białka, peptydu, przeciwciała itp. Za pomocą pipety P20.
6. Pozostaw kropki do wyschnięcia. Można zostawić na noc na szalce Petriego.
7. Zablokuj 5% odtłuszczonym mlekiem (w TBST) na 1 godzinę. (niektóre białka wymagają większej ilości odtłuszczonego mleka np. 5% i dłuższej inkubacji w chłodni np. 30 min.)
8. Przepłucz dwukrotnie TBST 1 min. każdy.
9. Inkubacja przeciwciał pierwotnych: łącznie 10 ml – przeciwciało pierwotne rozcieńczone do odpowiedniego stężenia w TBST + 1% BSA 1 godz.
10. Przepłucz dwukrotnie TBST 1 min. każdy.
11. Inkubacja przeciwciał wtórnych: rozcieńczenie 1: 5000 drugorzędowej peroksydazy chrzanowej (wybierz właściwą wtórną peroksydazę chrzanową kozią przeciw królikowi (HRP) lub HRP kozią przeciw mysiemu w zależności od rodzaju zastosowanego przeciwciała pierwotnego), 30 minut
12. Przepłucz dwukrotnie TBST 1 min. każdy.
13. Płukać dwukrotnie TBS + 1% Triton X-100 30 min. każdy, a następnie wywołać plamę.
    (Zauważ, że peroksydaza chrzanowa jest enzymem i dlatego jest wrażliwa na temperaturę, więc najlepiej pozostawić ją na 4 stopnie, jeśli nie można od razu kontynuować jej rozwoju; jednak staraj się nie zostawiać jej na 4 stopnie zbyt długo [1-2 godzin jest prawdopodobnie OK])

Przeglądanie blota

1. wymieszać równe ilości roztworu A i B ECL (~ 1,5 ml każdego z A i B)
2. osuszyć ten roztwór ręcznie przez 1 min.
3. owinąć Saran Wrap wokół plam
4. zdjąć rękawiczki podczas przenoszenia folii
5. wyłącz wszystkie światła (może pozostawić przyćmione czerwone światło) podczas wyjmowania folii z pudełka i włóż pozostałą folię z powrotem do pudełka przed przystąpieniem do pracy z nowo usuniętym kawałkiem filmu
6. umieść film na górze kliszy w kasecie z filmem, notując orientację filmu
7. naświetlaj przez 15 sekund -2 minuty, a jeśli to konieczne, użyj innego filmu i naświetlaj przez 20 minut.
8. rozwinąć plamę