10x sól fizjologiczna buforowana fosforanem PBS (do usuwania metanolu z blotów)
NaCl 80g (1,37 M na 10x)
KCl 2g (27mM dla 10x)
Na2HPO4 (80 mM dla 10x)
KH2PO4 (20 mM dla 10x)
woda do 1L
pH do 7,4 z HCl

PBS Tween®PBST (do płukania plam)
PBS 2L
Tween-20 (brązowa butelka) + 1 ml przez wlanie pipetą pipetą lub plastikową gruszką
mieszać pół godziny

Protokół :

Blotting

1. Zwilż wysuszony, przeniesiony blot metanolem, jeśli blot jest wykonany z PVDF lub namocz w PBS, jeśli blot jest wykonany z nitrocelulozy (pamiętaj, że metanol jest toksyczny, więc noś rękawiczki i nie wdychaj go). ZMOCNIJ METANOLEM LUB W INNY SPOSÓB ROZRÓŻNI SIĘ W TWOICH RĘKACH
2. Przepłucz ~ 4x PBS, aby pozbyć się metanolu
3. Umieść blot odwróconą stroną do góry w celu usunięcia
4. Blokuj 1-5% BSA przez 10 min. na noc (w razie potrzeby blokuj pod kątem 4 stopni) – blok z 5% BSA i na noc, jeśli jest wysokie tło, i mniej, jeśli jest mniej tła
5. Inkubacja przeciwciał pierwotnych: łącznie 10 ml – przeciwciało pierwotne rozcieńczone do odpowiedniego stężenia w PBS (+ 0,2% BSA) 1 godz.
6. Pranie: 3x 10 min. każdy PBST
7. Inkubacja przeciwciał wtórnych: rozcieńczenie 1: 5000 drugorzędowej peroksydazy chrzanowej (należy wybrać właściwą drugorzędową peroksydazę chrzanową kozią przeciw królikowi (HRP) lub HRP kozią przeciw mysiemu w zależności od typu zastosowanego przeciwciała pierwotnego), 30 minut
8. Więcej prań: ~ 5x PBST po 5-10 minut
   (Zauważ, że peroksydaza chrzanowa jest enzymem i dlatego jest wrażliwa na temperaturę, więc najlepiej pozostawić ją na 4 stopnie, jeśli nie można od razu kontynuować jej rozwoju; jednak staraj się nie zostawiać jej na 4 stopnie zbyt długo [1-2 godzin jest prawdopodobnie OK])

Przeglądanie blota

1. wymieszać równe ilości roztworu A i B ECL (~ 1,5 ml każdego z A i B)
2. kołysać ręcznie przez 1 min.
3. owinąć Saran Wrap wokół plam
4. zdjąć rękawiczki podczas przenoszenia folii
5. wyłącz wszystkie światła (może pozostawić przyćmione czerwone światło) podczas wyjmowania folii z pudełka i włóż pozostałą folię z powrotem do pudełka przed przystąpieniem do pracy z nowo usuniętym kawałkiem folii
6. umieść film na górze kliszy w kasecie z filmem, notując orientację filmu
7. naświetlaj przez 15 sekund -2 minuty, a jeśli to konieczne, użyj innego filmu i naświetlaj przez 20 minut.
8. rozwinąć plamę

ELISA z BSA jako agentem blokującym

Materiały

Płytki mikrotitracyjne Nunc (średnio wiążące) Polysorp F96 475094 (płytki RIA)
Maxisorp F96 442404

ABTS (dostępne na przykład w Sigma)

Bufor A
Wodoroortofosforan disodu 1M (20 ml wody)
Kwas cytrynowy 1M (16ml wody)
Połączyć i rozcieńczyć do 164 ml, pH do 4,0
Przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej

Uwagi

Wykonaj próbki w trzech egzemplarzach

• 60ul każdego roztworu do dołka za każdym razem; popłuczyny / płukania są stosowane w celu wypełnienia dołka i usuwane przez odwrócenie płytki i wyrzucenie nadmiaru roztworu

Należy zauważyć, że wszystkie białka (w tym BSA) używają 1x PBS jako rozcieńczalnika

Odmiany obejmują stosowanie pewnych białek przy użyciu seryjnego lub 10-krotnego rozcieńczenia

Potrafi użyć pipety wielokanałowej, aby przyspieszyć dostarczanie roztworów do płytek mikrotitracyjnych

Procedura

• Płytkę Protein 1 przez noc w 37 stopniach w inkubatorze (przykryj 1mL pudełkiem na końcówki pipety) – rozcieńczyć białko do 1 do 100 ug / ml
• Wypłucz PBS
• Blok z 4% BSA w PBS, 1 godzina
• Wypłucz PBS
• Dodaj Białko 2 + 0,1% BSA
• Inkubować 1-4 godziny w temperaturze pokojowej lub w 37 stopniach Celsjusza
• Przemyć 3x PBS-Tween
• Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej z Białkiem 3 (jeśli występuje) + 0,1% BSA
• Przemyć 3x PBS-Tween
• Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej z Białkiem 4 lub przeciwciałem skoniugowanym z – peroksydazą (rozcieńczyć białko sprzężone z peroksydazą lub przeciwciało 1/1000 PBS-Tween) + 0,1% BSA
• Przemyć 5-6x PBS-Tween
• roztwór wywołujący (5mg ABTS w 10mL Buffer A + 10uL H2O2) sporządzić tuż przed użyciem i przechowywać w ciemności przed użyciem
• Odczekaj 15 minut (owinąć folią, aby światło nie docierało)
• Odczytać płytkę do mikromiareczkowania czytnikiem płytek przy 405 nm

W przypadku kontroli pomiń każde białko lub BSA.
Inną kontrolą mogłoby być niespecyficzne przeciwciało pierwszorzędowe zastępujące zwykłe i BSA zastępujące Białko 1.