Generowanie kolumny powinowactwa za pomocą Sepharose

  1. Wziąć 10 ml Sepharose 2B i przemyć kilkakrotnie wodą przez odwirowanie. Nie wirować zbyt szybko, ponieważ może to złamać kulki Sepharose. Odwirować wystarczająco szybko, aby granulować kulki.
  2. Wlej przemytą Sepharose do małej zlewki (około 50-100 ml) zawierającej równą objętość wody i delikatnie wymieszaj mieszadłem pod wyciągiem.
  3. Wyjąć bromek cyjanu około pół godziny przed użyciem. Należy pamiętać, że bromek cyjanu jest wyjątkowo toksyczny i należy go otworzyć pod wyciągiem. Ponadto każdy roztwór, który miał kontakt z bromkiem cyjanu, powinien być użyty na wyciągu. Zważyć pustą probówkę Falcon 15 ml czułą wagą analityczną z zapisem do 4 miejsc po przecinku i wytarować wagę. Zostaw notatkę na wadze, że jest w użyciu. W okapie wyciągowym użyj szpatułki, aby przenieść niewielką ilość (około 0,19 g) do rurki Falcon. Pozostaw szpatułkę w okapie do końca zabiegu, kiedy spłukujesz szpatułkę w okapie. Podejdź do wagi, aby sprawdzić wagę bromku cyjanu. Jeśli jest go za mało lub za dużo, wróć do okapu i odpowiednio wyreguluj. Po zakończeniu usuń notatkę z wagi.
  4. Przygotuj butelkę 0,2 M NaOH pod wyciągiem i dodaj kroplę NaOH do zlewki z sefarozą, mieszając mieszadełkiem, i umieść w roztworze elektrodę pH-metru. (Elektrodę należy najpierw przepłukać wodą.) PH powinno osiągnąć wartość między 10-11. Jeśli nie, dodaj więcej NaOH aż do osiągnięcia tego pH.
  5. Dodaj bromek cyjanu do zlewki. Mieszaj dalej. Utrzymuj pH roztworu w zakresie 10-11, dodając 0,2 M NaOH w miarę spadku pH. Kontynuuj przez 30 minut lub nieco dłużej, aż pH ustabilizuje się w miarę dobrze.
  1. Pod wyciągiem przenieść roztwór do probówki Falcon o pojemności 50 ml, dodać trochę zimnego 20 mM boranu sodu o pH 8,4 i szczelnie zamknąć roztwór. Odwirować wystarczająco szybko, aby osadzić kulki. W okapie otworzyć rurkę, wyjąć roztwór za pomocą pipety i do zlewu okapu lub zlewki w okapie. Powtórz pranie jeszcze 3 razy.
  2. Po ostatnim płukaniu usunąć boran sodu, dodać do kulek około 16 mg stężonego przeciwciała lub innego białka dializowanego do 20 mM boranu sodu, pH 8,4. Na tym etapie wygodniejsze może być przeniesienie perełek i przeciwciał do probówki Falcon o pojemności 15 ml, jeśli objętość pasuje.
  3. Kołysać, obracać lub mieszać roztwór białka perełek w 4 stopniach C przez 4 godziny.
  4. Umyj szkło lub inny sprzęt laboratoryjny, który dotknął bromku cyjanu w okapie.
  5. Po 4 godzinach sprawdź A280, aby upewnić się, że zmniejszył się i że większość przeciwciał lub białek związała się.
  6. Zatrzymać reakcję sprzęgania przez dwukrotne przemycie kulek Sepharose w TBS (20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl) z 50 mM glicyną przez odwirowanie.
  7. Przechowuj kolumnę powinowactwa w 4 stopniach C w TBS bez glicyny.
  8. Kolumny powinowactwa można używać w małych objętościach. Więcej informacji na temat procedur oczyszczania można znaleźć w Protokole chromatografii immunopowinowactwa.