Protokół podklonowania

Poniżej znajduje się krótki protokół procedury subklonowania:

  1. Przeanalizuj miejsca restrykcyjne wektora, z którego chcesz przenieść gen do wektora docelowego – miejsca restrykcyjne powinny być obecne od 5 ‘do 3’ w tej samej kolejności dla obu wektorów.
  2. Upewnij się, że twój gen (y) nie zawiera żadnego z miejsc restrykcyjnych, którymi zdecydowałeś się wyciąć swój gen.
  3. Wytraw gen z oryginalnego wektora enzymami restrykcyjnymi zgodnie z podanymi instrukcjami i oddziel gen od wektora przez naniesienie na żel, wycięcie żądanego prążka przed oglądaniem w świetle UV i wykonanie ekstrakcji żelu. (np. Qiagen).
  4. Wytraw miejsca restrykcyjne z wektora docelowego i oczyść wektor w celu usunięcia DNA znajdującego się między miejscami restrykcyjnymi.
  5. Wykonaj ligację z wyciętym genem i wektorem docelowym.
  6. Przekształć żądaną ilość zligowanego produktu do kompetentnych komórek bakteryjnych.
  7. Wybierz żądane kolonie i wyhoduj bakterie w nocnych hodowlach.
  8. Oczyścić plazmid (np. Można użyć zestawów handlowych).
  9. Przechowywać oczyszczony plazmid w -80 stopni C lub -20 stopni C w porcjach.
  10. Jeśli przeprowadzono ligację, w której zastosowano ten sam enzym restrykcyjny po obu stronach insertu, konieczne jest sprawdzenie z innymi enzymami restrykcyjnymi lub sekwencjonowanie, aby upewnić się, że wstawka została wstawiona we właściwej orientacji.